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血友病A的携带者检测与产前诊断

作者:王学锋 时间:2001-06-16 15:37 浏览:

[摘要] 目的 建立简便、快速的血友病A携带者检测与产前诊断体系。方法 用PCR方法直接检测FVIII内含子22倒位或对FVIII基因内的BCL I位点,内含子13和22中STR和FVIII基因外的DXS 52(ST14)位点的多态性进行遗传连锁分析。结果 应用内含子22倒位的直接诊断率为47.6%;- BCL I位点的可诊断率为27.8%;?内含子13和22中STR的可诊断率分别为28.6%及29.4%;ˉDXS 52的可诊断率为81.3%;°综合应用直接诊断和间接遗传连锁分析,对 21 家系进行检测,可诊断率为94.7%。 结论 血友病A的携带者检测与产前诊断可先进行内含子22倒位的检测,阳性结果即可作出诊断;若内含子22倒位的检测结果阴性,则可利用FVIII基因内、外的多个位点多态性结果进行遗传连锁分析,以得出最终的诊断。
  
  [关键词] 血友病A 携带者 产前诊断
  Carrier detection and prenatal diagnosis on hemophilia A
  
  WANG Xuefeng,LIU Yuanfang,LI Zhiguang, et al。Ruijin Hospital Affiliated to Shanghai Second University,Shanghai Institute of Hematology,Shanghai 200025
  [Abstract] Objective To establish a simple,rapid carrier detection and prenatal diagnosis system on hemophilia A. Methods Intron 22 inversion was directly examined by long distance polymerase chain reaction or heredity linkage analysis by combined utilizing polymorphism of factor VIII intragenic RFLP of Bcl I , STR within intron 13 and 22 ,as well as extragenic DXS 52(St 14) VNTR loci were done. Results The diagnostic rates of these loci are 47.6%(intron 22 invertion) ,27.8% (Bcl I),28.6% and 29.4%(STR within intron 13 and 22),as well as 81.3%(DXS52) respectively; comprehensive utilization of above loci, the total diagnostic rate of 21 families is 94.7%. Conclusions If the intron 22 inversion is present , we can determine the diagnosis of hemophilia A patients or carriers; if the results is negative, we can do the heredity linkage analysis and get the ultimate diagnosis by comprehensively using the intragenic and extragenic loci .
  [Key words] Hemophilia A, carriers, prenatal diagnosis
  
  血友病A(hemophilia A,HA)是X性联隐性遗传性、出血性疾病,临床上甚为常见。由于目前尚缺乏对本病的根治措施,故致病基因的携带者检测与产前诊断无疑是减少发病及提高人口素质的一个有效手段。我们在聚合酶链反应的基础上建立起简易、快速并易于推广的检测体系,现报道如下。
  
  材料与方法
  
  1. 病例 HA家系21个,分别来自上海、浙江、山东、河南、福建、江西等省市,其中1个无家族史,为散发家系。5个家系的5名性胎儿需做产前诊断,其余家系中的35名女性需做携带者诊断。先证者均经本院或当地省级医院血液专科医师按HA的诊断标准进行确诊[1]。
   2 .材料 主要试剂长距离聚合酶链反应(long distance polymerase chain reaction,LD-PCR)引物为大连宝生物工程有限公司(Takara)产品:P 5¢-GCC CTG CCT GTC CAT TAC ACT GAT GAC ATT ATG CTG AC-3¢; Q 5¢-GGC CCT ACA ACC ATT CTG CCT TTC ACT TTC AGT GCA ATA-3;B 5¢-CCC CAA ACT ATA ACC AGC ACC TTG AAC TTA CCC TCT-3¢。-下列引物购自上海生工生物工程公司,*为带有6羟基荧光素(6-carboxyfluorescein)引物。DXS52引物 P1 5¢-GGC ATG TCA TCA CTT CTC TCA TGT T-3¢,P2 5¢-CAC CAC TGC CCT CAC GTC ACT T-3¢;BCL-I RFLP引物 :P1 5¢-TAA AAG CTT TAA ATG GTC TAG GC-3¢, P2 5¢-TTC GAA TTC TGA AAT TAT CTT GTT C-3¢;内含子(intron) 13 短重复顺序(short tandem repeat,STR)引物 :P1 5¢-TGC ATC ACT GTA CAT ATG TAT CTT-3¢,P2 *5¢-CCA AAT TAC ATA TGA ATA AGC C-3¢;intron 22 STR引物 :P1 5¢-TTC TAA GAA TGT AGT GTG TG-3¢, P2 *5¢-TAA TGC CCA CAT TAT AGA -3¢。?Taq酶 LD-PCR 所用Taq酶由Takara提供,其他PCR反应所用Taq酶系上海生工产品。ˉdNTP 由Takara提供,LD-PCR所需deaza-dGTT购自Pharmacia Biotech公司。°Bcl I酶购自Promega公司。
   3. 样品DNA提取方法家系成员外周血,常规蛋白酶消化,酚-氯仿法提取基因组DNA,部分样品使用Takara基因组DNA提取药盒抽提DNA。-产前诊断孕妇在怀孕16-22周在B超指引下抽取羊水20ml,参考文献介绍的方法提取脱落细胞DNA[2]。
   4 .PCR 扩增 选用Thermolyne AMPLITRON II PCR仪。LD-PCR 反应体系包括2′ GC buffer I 25ml,dNTP(各2.5mM,其中dGTP/7-deaza- dGTP=3:1)8ml,引物P、Q、B(20 mM)分别为0.5、0.25、0.5ml,模板DNA 1ml(约100ng),Takara LD Taq酶(5U/ml) 0.5ml,总体积50ml。反应条件为:94°C预变性1min,98°C变性10s,68°C延伸/退火10min,共30个循环。后20个循环中,每一个循环的68°C延长20s。最后一次72°C延伸10min。-其他PCR反应 总体积为50ml,其中模板DNA为300ng,dNTP250mM,引物各0.5mM,常规缓冲液浓度,Taq酶2U。各位点的反应条件分别为1)DXS52 VNTR:首次循环为94°C变性8min,60°C退火3min,70°C延伸4min,而后94°C 1min,60°C 50s,70°C 4min,如此循环26次,最后一次70°C延伸3min。2)Bcl I RFLP:首次循环为94°C变性5min,58°C退火90s,70°C延伸30s。随后,94°C 30s,58°C 1min,70°C 30s,共35个循环,最后一次72°C延伸3min。3)内含子13与22中的STR:94°C预变性10min,94°C 30s,50°C 50s,72°C 40s,共35个循环,最后一次72°C延伸10 min。
   5.结果分析 LD-PCR产物用0.6%琼脂糖凝胶,60V电压下电泳8小时后,紫外光下观察电泳条带并摄影。-DXS52位点PCR产物在1.5%琼脂糖凝胶上110V电压下电泳1-1.5小时后,紫外光下观察电泳条带并摄影。?Bcl I位点PCR产物尚需经Bcl I酶(Promega公司)50°C酶解过夜后,用 10%丙酰胺凝胶(PAGE)电泳(80V,60min-90min),溴乙锭染色后,紫外光下观察电泳条带并摄影。ˉ内含子13与22中的STR位点PCR产物的分析,系在ABI377 DNA测序仪上电泳后,应用GENESCAN和GENOTYPE软件进行基因分型。
  
  结果
  
   1. 内含子22倒位直接检测 正常人DNA经LD-PCR后,从引物P、Q可以扩增出单一的12kb条带,包含内含子22中F8A基因(图1中A1)。当F8A与其上游约400kb处的两个与之高度同源的系列(图1中A2与A3)之一发生染色体内同源重组时,LD-PCR应扩增出引物P与B之间的一段序列,为11kb。因此,男性FVIII基因若发生内含子22倒位,LD-PCR的产物为11kb;与其有血缘关系的女性携带者的LD-PCR产物为12kb及11kb。图2为一个重型血友病A家系LD-PCR的检测结果。该家系中先证者III-1 PCR产物为11kb,说明先证者FVIII基因存在内含子22倒位。通过追踪这一个分子缺陷,即可对此家系中的相关女性进行携带者及产前诊断。先证者母亲II-2为12 kb /11 kb,说明其为致病基因的携带者。II-2再次妊娠时对其胎儿III-2进行产前诊断,后者显示单一的12kb条带,说明其为健康男性。
   2.DXS52 VNTR位点多态性用于HA基因连锁分析 图3家系的DXS52 VNTR位点共有A、B、C、D四种多态性。由于先证者(III-1,基因型为B/-)的多态性片段与致病基因连锁,根据扩增片段的多态性及遗传规律可以判断先证者的母亲(II-2,基因型为B/C)、外祖母(I-2,基因型为B/D)、姨母(II-3,基因型为B/C)为致病基因的携带者,而家族中另一女性(II-4,基因型为C/D)为正常人。
   3. Bcl I位点多态性用于HA基因连锁分析 由于图4家系中先证者(III-1,基因型142/-)的母亲为Bcl I酶切位点的杂合子(142/99),其一条X染色体(无Bcl I酶切点,基因型142)携带致病基因,胎儿的基因型为(99/-),因此其为正常男性。
   4. 内含子13与22中的STR多态位点用于HA基因连锁分析 以内含子13的STR为例,图5家系由于先证者(III-1)为(CA)23/Y即(147/Y),故与致病基因连锁的为(CA)23。PCR结果经基因扫描,可见该家系中II-2、II-3、III-2、III-3均为血友病A致病基因携带者。
   5 多位点综合分析 本研究中联合应用直接与间接诊断措施,21个HA家系中仅1个家系无法确立诊断,诊断率达94.7% 。5个产前诊断家系均获明确诊断,其中4例为正常男性,1例为HA患儿(表1)。
  
  表1 直接诊断与间接诊断结果
  
  位点 家系数 需诊断女性 需诊断胎儿 可诊断家系 诊断率(%) 诊 断 结 果
   正常女性 携带者 正常胎儿 HA患儿
  INV 22 21 16 3 10 47.6 10 6 3 0
  DXS52 16 26 5 13 81.3 14 6 3 1
  BCL I 18 35 5 5 27.8 4 5 1 0
  CA 13 14 24 5 4 28.6 5 3 0 0
  CA 22 17 30 5 5 29.4 8 3 0 0
  
  讨论
  
   携带者及产前诊断的目的是区别携带者及正常女性,使后者可以正常婚育;-对携带者的胎儿进行基因检测,以避免HA患儿出生。FVIII基因位于Xq28,长达186kb,包括26个外显子和25个内含子,编码长约9kb的mRNA。由于导致血友病A的FVIII基因突变主要为内含子22倒位(重型患者中约50%患者发病与此有关)和异质性极强的点突变,因此携带者或产前诊断应首先进行内含子22的倒位检测,若家系成员检测结果阳性即可诊断为HA患者或致病基因的携带者。内含子22倒位检测属直接检测HA的基因缺陷,所以对一些家系成员不全或由于新生突变所致HA的家系尤其重要。以前内含子22倒位采用Southern印迹法进行检测,尽管因此可以鉴别远端及近断倒位,但操作过程复杂,检测周期长,且需使用放射性同位素标记探针,因此很难用于临床常规检测。我们在Liu的方法上加以改进,所建立的LD-PCR方法,扩增长度达10kb-12kb。由于扩增链较长且包含了3.5kb的GC岛,其中更有1kb区域GC含量高达79%,普通PCR反应难以完成。通过改变反应条件,如应用LD-PCR专用Taq酶、提高变性温度至98°C以及在dNTP中使dGTP:7-deaza-dGTP之比达3:1,将退火与延伸温度统一为68°C等最终使扩增得以实现[3]。
  对于不存在内含子22倒位的家系进行携带者或产前诊断,利用基因多态性进行遗传连锁分析则成为重要手段。DXS52(ST14)位点在遗传图谱上距FVIII基因的相对距离为2cM,是一个具有多个等位基因的可变数目串联重复顺序(variable number tandem repeat, VNTR)位点。中国人该位点的等位基因数比欧美人略少,其中700bp的出现频率最高。陈维之等报道女性的杂合频率为61.3%[4];金正莲的结果是该位点的多态信息含量(PIC)为76.36%[5]。我们对16个家系的检测结果有13个该位点可以提供信息,诊断率为81.3%。因此,该位点具有较高的实用价值。但DXS52 位点位于基因外,与FVIII基因间存在2%重组的可能。因此,单独应用此位点进行诊断时应予注意。Gitschier[6]等将FVIII基因内含子18中的Bcl I RFLP用于HA携带者或产前诊断。该位点的杂合子频率白种人与中国人没有明显差别,约在30%-40%[7]。我们单用该位点的RFLP进行分析,18个家系中仅有5个家系可以诊断,诊断率为27.8%。FVIII基因中的短重复顺序(short tandem repeat,STR)包括内含子13中的(CA)n及内含子22中的(GT)n(AG)n 。Lalloz报道内含子13中(CA)n的等位基因至少有10种,杂合频率为91%;内含子22中的(GT)n(AG)n等位基因至少有6种,杂合频率为33%[8]。但我们对所有21个家系的检测发现内含子13与22中STR的等位基因分别仅5个和3个,二者的单独可诊断率为28.6%和29.4%。这种差异可能是由于遗传背景的不同及较小的样品数量所引起。此外,我们尚发现在检测的家系中,内含子13与22中的STR的杂合情况趋向一致,即若内含子13 STR为杂合状态,其内含子22的STR也往往与之一致。提示该二位点存在连锁的可能性。除内含子22倒位、DXS52位点的多态性外,我们发现其他遗传标志所获信息量较低,不能令人满意。因此有必要联合多个遗传标志进行诊断。此外,由于间接诊断有引起误诊的危险,因此直接诊断结果阴性时,推荐使用联合应用多个遗传多态性标志以提高诊断率及确保正确率。我们在21个家系诊断中联合应用内含子22倒位、DXS52、Bcl I及内含子13及22中的STR检测,对21个家系中的20个最终做出诊断,诊断率达94.7%。但1个家系经检测上述5个位点均未得到有关信息,无法作出诊断,因此在中国人群中尚有待开发更多的FVIII分子内信息量大的分子遗传标志,以提高HA的携带者及产前诊断的可诊断率。
  (安徽省立医院的吴竞生教授为我们提供了部分家系并给予指导,谨致以衷心的感谢)
  参考文献
  1. 张之南主编.血液病诊断与疗效标准.北京:科学技术出版社,1998.304.
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  3. Liu Q,Nozari G,Sommer SS. Single-tube polymerase chain reaction for rapid diagnosis of inversion mutation in hemophilia A. Blood 1998;92(4):1458-1459
  4. 陈维之,周道斌,武永吉.DXS 52 VNTR位点多态性频率分布的研究.中华血液学杂志 1998;19(4):209-210
  5. 金春莲,林长坤,宋军等.东北地区正常人群DXS52(DXS 52)位点VNTR在甲型血友病基因诊断中的应用.中华遗传学杂志 1998;15(1):31-33.
  6. Gitscher, Drayna D, Tuddenham EGD,et al. Genetic mapping and diagnosis of hemophilia A achieved through a BCL I polymophism in the factor VIII gene. Nature 1985;314:738-740.
  7. Borjas Fajardo,Pineda Del Villar L, Arteaga Vizcaino M, et al.Analysis of Bcl I polymorphism of factor VIII gene in the molecular diagnosis of hemophilia A carriers in families from northwestern Venezuela. Sangre Barc 1999,44(1):19-23.
  8. Lalloz MRA,Schwaab R,McVey JH, et al. Haemophilia A diagnosis by simutaneous analysis of two variable dinucheotide tandem repeats within the Factor FVIII gene.Br J Haematol 1994,86:804-809.

 

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