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血浆蛋白分离新进展和病毒灭活

作者:刘文芳 译 时间:2001-02-03 15:20 浏览:

摘要:
   已经使用乙醇分离法50多年,从人血浆制备一些治疗蛋白组分。虽然这个方法是非常成功的,但是已有一些更新的技术,它们至少可以部分替代乙醇分离法。是否提供这些新的方法将取决于经济利益。虽然现在通过血液制品传播病毒已罕见,但是研究灭活和/或去除病毒的一些方法仍在继续。特别是细小的,非脂包膜病毒特别困难,任何的新方法应最优先地强调这个问题。至今,通过血液和血制品还没观察到海绵状脑病的传播(克罗伊茨尔将特一雅各布综合症和相似的疾病)。初步的试验证据指出公认引起原体在血浆蛋白分离过程中被去除。
  前言:
   长期以来,乙醇分离法已经用于制药工业,这更进一步证实这些制品的医学需要和技术的可靠性。在另一方面,血浆分离工业在整个进程中也已经慢慢地接受一些新的技术并也发展了一些新的制品。近来有两个相对的事件是根本的原因,也就是已经开始和将继线l、工业规模使用重组技术的可能性,至少在理论上,从非人源得到不定量的蛋白质。2.已经认识到使用血和血液制品时对这些蛋白质的许多受者传播病毒,特别是HIV。
  乙醇分离法:
   乙醇分离法仍是世界范围内最广泛使用的人血浆分离方法。基本原理是二次世界大战时哈佛大学Cohn及同工发展的,虽然已经知道早期使用甲醇。50多年来尽管有一些修改和完善,目前还在使用这一方法,为什么这个方法那么流行呢?
  l、这个方法已很好地被确立,总体说有相当好的安全记录。
  2、每一个制定规章制度机构,包括FDA已经接受这个方法。
  3、这个方法仅使用一些化学试剂,来源便宜、易得,通常也是安全的(GRSA)。
  4、实际使用的沉淀剂乙醇,可以容易地在配制最终产品时,用层析法,透滤法或冻干法去除乙醇,也对以用蒸馏法回收并再利用。
  5、在分离过程中体积的膨胀是不大的,这对于分离过程的经济费用是一个重要的贡献。
   6、要求低温(为了避免蛋白变性)以及乙醇本身都抑制细菌生长;然而,乙醇分离
  1虽然通过仅几步分离就可以得 纯度好的主要成分如白蛋白和免疫球蛋白,但是,
   另一方面对于一些微量的血浆蛋白成分就不可能下叵
   (2)一些蛋白的回收(包括白蛋白和免疫球蛋白)是不完全的,因此,大量有价值的人源物质被浪费
   3)工业用的乙醇潜在污染已经引起一些注意,因为使用大量乙醇这些污染(即甲醇、 酮)可能涉及到终品的安全。
   (4)使用乙醇即使在相对低的浓度和低温时,一些敏感蛋白质的生物学功能都被损害 或破坏
   任何新的分离方法都将必须完全与己很好确定的乙醇法相对比。在接受之前,将判定每一个新方法时主要标准是它的潜在形成的大量安全性以及分离的纯制品的成本比乙醇法则较低
   其它的沉淀法完全取代大规模的乙醇法是非常不可能的。虽然己经广泛地在实验室规模使用硫酸铵,在商业工厂由于环境污染物质的处理问题,它的使用经常被限制。为了一些特殊的目的仅仅使用其它一些沉淀剂如辛酸。一组方法,这些方法是层析法可能在未来起着重要的作用。
  层析法
  在过去层析法已经广泛地用于血浆分离。从乙醇法分离白蛋白,分离IX因于复合物或近来抗Rh免疫球蛋白都证明层析法的能力。较新的变形,特别是亲和层析,对未来的血浆分离可能有更大的冲击,因为它们增加更大的特异性。
  亲和层析
   虽然己经发展了用一个小的相互作用的分子作为范例的概念,它可能容易地扩展到大分子像一些蛋白质。第一个商业例子就是借助于抗VIII于或它相关的分子如Von willebrand因子的抗体来分离VIII因子。一些方便抗体的使用要防止亲和层主要问题:如何发展一些特异性,特别是蛋白的配体。幸运的是,现在有二种新方法允许快速筛选许多潜在的候选者。
  噬菌体显示技术
   可以使用噬菌体在短时间内形成关于噬菌体未大量的肽类或小量的蛋白质。因为噬菌体可以容易生长,选择和用近来的一些方法繁殖,他们代表一个理想的识别适宜的肽或蛋白质的载体,这些肽或蛋白质结合到血浆蛋白。从天然来源即免疫动物或人)获得的核酸库或从试验试管内形成的随机核昔酸集合体被得到肽或蛋白质的信息。可以用重组技术或化学合成短肽形式,以适宜的数量制备大多数适合的肽或蛋白质。有时第二个筛选范围可能是必须的,因为同样的肽或蛋白质当偶联到刚性层析携带物时可能表现出困难性。大多数适宜的候选者对适合的携带者因相化后,可以用它作为一个分离的成分。
  结合化学(Combinatoal chemistry)
   结合化学代表另一制备条和层析配体的方式。通常,第一步要求一个适度的方法以限制必须探索的可能性。更深地来分析目标蛋白和(天然)配体之间的己知的相互作用的关系。用系统的单一化学封闭,把它添加到刚性的支持物,然后来重新构成配体的接触表面。
   可以先后使用这两种方法噬菌体显示作为第一个适合配体的选择,结合化学作为一种工具获得更小的,更稳定的配体,这个配体可以用合成的方法获得
  。一些层析方法的局限性
  :正如以上所述,乙醇分离法不要求过程的操作体积大于原始血浆相反一些层析法可以适用于稀释的蛋白溶液。因此,在无乙醇存在下,这些蛋白溶液提供细菌生长的良好状况,这种状况必须靠其它方式来控制。因为一些层析支持物\除离子交换和排阻介质外)都是贵重的,他们需要重复使用,
   因此,必须清洁它们。已知的最好化学或物理的清洁是苛刻的(高PH,攻击性的化学试剂、高温)并且常常涉及到配体,特别是肽类,甚至一些蛋白质。如果在批间清洗不完全,那么就存在批间的交叉污染的危险。
   从层析柱上防止配体滤去或防止 部分配体 降解可能是 一个问题,特别是较大的一些配体,这些配体提供许多不同的损坏部位。因此,许多基于亲和层析的分离方时都包括一个额外的从目标蛋白中分离去除损失的配体的步骤。乙醇分离法相对地耐受蛋白质溶液章有大量悬浮的颗粒,这种情况可能与血浆有关。它的脂含量经常导致分离混合血浆很混浊。随后用离心法或过滤法从满相分离固相并不被脂颗粒所阻止。在另一方面,一些成分倾向安于阻塞层析系统,如果不预先去除这些成分,然而,混浊血浆的过滤是—门技术。
   目前,一些居析法似乎是将更加完善而不是取代乙醇分离法。在一体化分离图示中,可以设想乙醇法作为第一步,此步粗略地把血浆蛋白分离成二个组分,并在相同的时间为随后的过程提供清亮的溶液。然后用层析法进一步处理这两个组分,用一个特殊的吸附剂捕捉提出一些治疗用的蛋白质。还不能完全排除一些新方法的可能性,这些方法会基于新的原则允许血浆分离。
  基因工程
   一些重组蛋白质并不直接地冲击血浆蛋白分离本身(正如上面已叙述,除了作为分离工具 使用以外)。然而,产生的一些蛋白质的可能恰与不求助于人血浆间带有天然的原型是完全同一的,这已经对血浆分离工业有了显著的影响。冷沉淀,过去Vlll因子的宝贵的原料,在许多情况下是血液采集的驱动力r现在已变成1个过剩的产品,因为重组的皿因子己能得到。现在重组IX因子(rFIX)也进入市场,与从血浆中用离子交换吸附的IX因子复合物竞争。老的IX因于复合物含有一些其它的维生素K依赖凝血因子 因此也用于除TX因子缺乏以外的的一些因子的治疗。很明显,对FrIX来说,IX因于己不可能更长了,而且一些病人对替代治疗发现一些制品可能有问题,因为商业上IX因子复合物生产也不太长了。
   _、纤维蛋白胶,在欧洲和日本也使用很长时间,但是只在最近才引进美国市场,它含有主要成分为纤维蛋白原、凝血酶和 Xlll因子现在所有的 三个成分都是来源于非血浆原料。
   重组蛋白的生产并不限于细胞培养生长,用适当的技术,可以使用其它的来源(所有动物,甚至植物),有时还带有一些显著的经济优点。使用它们更重要是有可能引起一些小的改变以重组天然血浆蛋白的类似物;并改进了特性。这可能设想,也就是延长凝血因子的半衰期,这会延长治疗期间的间隔。
   重组蛋自超过天然配对物显著优点是更加改进了终品的纯度。虽然一些污染而不是治疗的蛋白可以引起一些观察到的副反应,但是来源于人源的血浆许多其它成分的污染,通常不是严重的问题。在另一方面,一些重组蛋白相关的一些杂质来源于生产中使用的合成器,是动物或植物。因为认为它们在病人引起变态反应,因此必须去除它们到触发这种反应允许的浓度以下。
   原则上,虽然从一个蛋白到另一个蛋白这种障碍差别不一样,但是用重组技术可以获得每一个血浆蛋白。通常正确的糖基化是一个问题,但是有必要获得—个与原始评价的碳水化合物部分。一些蛋白质提出某些特殊的问题。白蛋白不必糖基化,但是使用量大。因此,重组蛋白必须相当纯,目的是不引起免疫反应。生产大量纯化的重组蛋白是一个非常艰难的任务。在另一方面,免疫球蛋白又不代表一个单一的实体,因为更确切地存在大约1叩个不同的混合物,尽管有接近的相关分子。目前,在任何的重组系统重复生产这种大量的物质都是不可能的。然而,它又是不确定的,这种大的变化对每~个免疫球蛋白应用都是必须的,在短时间至少形成一个有限度变化的系统,有可能实现。
   引进一些与天然配对物相同的或改进质量的重组蛋白质一定会大幅度改变血浆蛋白分离的经济情况。迄今为止,血浆的高成本可能会分派到一些成分白蛋白、免疫球蛋白、各种凝血因子、纤维蛋白原等。如果这些蛋白质的多半从非人源来制备,那么血浆成本将必须分派到少数一些制品,多半可能是免疫球蛋白,也可能是白蛋白。很清楚,这将不会降低制品的价格。
  病毒清除
   80年代,当制备者医生和使用认识到一些血浆蛋白对许多受者传播HIV时,关于来自血浆的治疗良好安全记录受到严重关注。已经存在的一些方法己快速地发展和提供了灭活和/或去除病毒。彻底的筛选仍然不过是一般安全概念总体的一部分,这种筛选最小功防止在血浆分离混合池中有过量高的病毒负载,这种负载可能倒任何时去除和或灭活病毒的方法的能力。
  病毒去除
   病毒去除在保证安全的终品上是一个重要的步骤。已经显示即使~些老的分离方法在制备一些治疗制品时也有从组分中通过物理作用去除病毒的能力。近~些年来,纳米膜过滤允许更好地控制一些病毒去除,纳米膜过滤在病毒和蛋白间使用大小的差异性(病毒吸附到帐时匕也可能行~定的作用)新型的滤器仍然在发展。很明显,去除相对大的,有膜病毒比小的,无膜病毒更容易,在病毒和蛋白间的大小差异性的倾向消失了。如果过滤的溶液含有足够直接抗病毒的免疫球蛋白,即使是小的病毒,也能被纳米膜过滤去除,因为通过结合抗体增加了它们的直径。
   因为任何的其它去除或灭活方法,必须回答的两个主要问题是,去除的有效性和对血浆蛋白质的影响,在模型试验中可以测定去除的系数,此时主要困难不是测定过滤前与后
  的实际的病毒滴度,但更确切是实验室情况下的规模。大多数过滤生产者提供~个选择不同大小尺寸的同一滤器,可以用于一些验证实验。纳米膜过滤对蛋白结构由于额外的剪切力仅有最小的影响。然而,制造者的义务是证明进一步引进后不改变制品的效力。
  病毒灭活
  
   目前,已有许多良好的病毒灭活方法,并在近年来有些综述己概括了它们的进展。然而,仍然有改进的余地因为近来得到一些方法都是全部的或主要的灭活大的有膜的病毒,同时有附加的抵抗力小的无包膜膜病毒可能逃脱灭活。仍然发展的一些方法艘用碘或一些小的化学活性分子作为消毒剂,紫外线或者光敏染料和可见光的结合即使在一些方面进步是诱人的,我们 然在等待着最终的火活方法。
   一个灭活方法会仅仅使用一些GRAS化学试剂,如果完全地要求它们在最终端灭活相去除它们。去除这些化学试剂U并不是简单的,但它是可靠的,通过一些步骤引起污染的危险,需要引注意。因此,光敏剂经光暴露后常常裂解而产生大量化学上不同的物质,以一步去除它们可能是困难的,适当强度的光照大容积血浆是一项困难的工程任务。从实验室方法到完全的生产规程也是一项要求的任务。
   这个过程应火活有膜病毒与无膜病毒一样,不损害治疗蛋白质。不幸的是,经验总是表明,非包膜病毒由于它们较简单的结构比有膜病毒更难于灭活。目前和将来什么人都认为灭活人血浆中所有的病毒是困难的,目标应得到一些令人鼓舞的,考虑在细胞成分像红细胞和血小板存在下,灭活病毒。
  Pr i ons
   近来,一个新的潜在威胁已经出现罕见的神经变性疾病也就是已知的海绵状脑病发测娘痛发生如同牛海绵状脑病(BSE)也像CJD)和其它人类相似的疾病。通过食物链,CJD)的变种已经与BSE相关连。所有的流行病监视资料指出,典型的CJD)这种事件还从未发生。由于缺少传播不能信服地证明,所以仍然是一种潜在的危险。
   提出试验证据是困难的,一些研究组仍然试图在血浆分离过程中追踪公认的成因病原体,称为Prion。至今,所有的结果显示乙醇分离子法各组分的感染性积累,对最终的一
  些不具有这种感染性。
   此篇综述译自首届国际输血学会会议(9--14, 7,2000)
  IJmorgenthaler:New Developments In plasmaFrac一
  刘文芳译

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