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PCR技术在血友病A基因诊断中的应用

作者:liuzheng 时间:2000-11-08 11:19 浏览:

 血友病A是常见的遗传性凝血障碍,它是由凝血因子Ⅷ的基因缺陷而致其功能异常的致其发病率改为1/1000男性,女性患者极为少见.在临床上,血友病大都有家族史,亦有约20~30%的患者为散发病例,为新生基因突变所致。

一、血友病的遗传学
    本病为X连锁隐性遗传病,其基因定痊于Xq28.因子Ⅷ(FVⅢ)基因全长约为186Kb,
  包括26个外显子和25个内含子,其mRNA全长约为9Kb,CDNA占为9009bp.其翻译产物为
  2351个aa残基的多肽链.在FVⅢ基因内含有多个酶切位点,在其翻译区尚有VNTR序列
  及(CA/n重复序列.
 二、FVⅢ基因突变的特点
    (一)大范围的缺失,重排,重复及括入仅点血友病A的5%
    (二)FVⅢ基因突变的主要类型为单碱置换所引起的点突变,目前还发现的单碱是
  置及在八十种以上,几乎涉及FVⅢ的所有外显子和部分内含子.
 三、PCR技术在血友病A基因产前诊断中的应用
    FVⅢ基因突变以点突变为主,而且有高度异质性,因此对患者的诊断10前还是主
  要依据临床表现进行,在一个家系内若要进行血友病A的产前诊断,则必须用连锁分
  析的方法,该方法的应用则必须满折方法有以下两种:
  (一).PCR-RFLP
    在因子组基因内及其复侧有多组RFLP位点可用为标记进行连锁分析进行产前诊
  断,常用的PCR-RFLP位点有两种,其引物序列,酶切片段多者情况见下表.
  
  位点 引物序列 内切酶 长度 酶解片段
  Ext18 5'-TAAAAGCTTAAATGG
  TCTAGGC-3' BclⅠ 142 99+43
   5'-TTCGAATTCTGAAATT
  ATCTTGTTC-3'
  Int22 5'-CACGAGCTCTCCATCT
  GAACATG-3' XbaⅠ 96.0 68+28
   5'-GGGCTGCAGGGGGGG
  GGGACAACAG-3'
  Int19 5'-GGCGAGCATCTACAT
  GCTGGGATGAGC-3' HindⅢ 717 469+167+81
   5'-GTCCAGAAGCCATTC
  CCAGGGGAGTCT-3'
  
  (二),Amp-FLP
    在FVⅢ区内尚有两个VNTP区,一个位于DXS52,另一个为(CA)n位于DX102内,它
  仍均具有复杂的多者性,亦可用于连锁分析,是引物及扩增产物的多者性见下表
  
  位置 引物 片段 范围
  DXS52 5'GGCATGTCATCACTTCT
  CTCATGTT-3' 14 0.7-3.0
   5'CACCACTGCCCTCACG
  TCACTT-3'
  DX102 5'GTAGTCTCAGTCGACA
  TGCTTTGAC3' 8 152±
   5'GCTGAGAAAGTAGATC
  CTAAGTGTTC3'
  
  (三)血友病APCR基因诊断程序
    1.母亲、先证者的RFLP及Amp-FLP,确定风险染色体
    2.检测胎儿性别(SRT)
    3.检测胎儿的RFLP及AmP-FLP
 四、散发病例FVⅢ基因突变的PCR检测
    由于因子FVⅢ的基因突变以点突变为主,而且具有高度特异性,因此,单独网点
  突变的检测方法仍以诊断,对于形发病例来说,可用PCR-SSCP,PCR-DGGE及其它的点
  突变是筛查方法确定点突变血友病A之间的关系具有重要意义,尤其是PCR-DGGE已用
  于血友病A基因点突变的筛查.

 

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