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凝血因子Ⅷ与中国人血友病甲研究进展

作者:刘建湘 王鸿利 时间:2000-11-09 05:48 浏览:

 血友病甲为最常见的遗传性出血性疾病,是由于血浆凝血因子Ⅷ(FⅧ)缺陷所致。FⅧ基因位于X染色体,所以患者绝大多数为男性,女性杂合子为携带者,而女性患者极少见。
  重型患者自幼即有反复自发性出血,不经治疗者往往造成关节畸形和致残。严重者可因颅内出血死亡。目前仍以替代疗法为主〔1〕。随着FⅧ基因的克隆和基因突变检测技术的发展,血友病甲的直接基因诊断和遗传咨询等方面已经取得突破性进展。基因治疗的实验研究也正开展得如火如荼。我国近年不仅对血友病甲进行了大规模的流行病学调查,也从分子水平进行了多方面的研究。
  
  1 FⅧ基因及突变
  
    通过原位杂交和体细胞杂交分析,FⅧ基因被定位于Xq28,1984年被克隆〔2〕。基因全长186kb,包括26个外显子,转录成9010bp的cDNA,含150bp的5’非翻译区(UTR)、57bp编码N-端19个氨基酸的信号肽、6996bp的蛋白质编码区及1806bp的3’端UTR。编码区只占基因总长的5%,其余177kb为内含子序列,长度从207bp至34.2kb不等。在56和1 241号密码子存在多态性。目前对FⅧ基因的转录调控序列了解不多〔3〕。
    在FⅧ基因内含子22中另有2个基因F8A和F8B。这是首次在哺乳动物发现的基因内基因。在这2个基因之间有一具有双向转录活性的CpG岛。F8A转录方向与FⅧ相反,F8B转录方向与FⅧ相同。在X染色体远端距F8A约500kb处另有2个F8A的同源基因。F8A可与2个同源基因之一发生同源重组,使FⅧ基因从外显子1~22倒位至X染色体长臂远端,而外显子23~26仍处于原位。分裂的两部分不能被剪接到一起,导致重型血友病甲〔4〕。
    国外已对白种人血友病甲基因突变进行了大规模检测,并建立了世界范围的因子Ⅷ基因突变数据库〔5, 6〕。除内含子22倒位约占重型病例的一半外,目前共检测到不同突变431种,其中单碱基置换导致的点突变261种(61%),缺失突变147种(34%),插入突变23种(5%)。无义突变均导致重型,而引起轻中型表现的点突变都是错义突变。约5%患者FⅧ抗原相对高于其功能活性(FⅧ:C),称为交叉反应物阳性(CRM+)。这些病例对研究FⅧ蛋白质结构与功能的关系有非常重要的价值。如凝血酶切割位点Arg 372 和Arg 1 689的点突变可导致CRM+。Tyr 1 680的突变影响与vWF的结合,使FⅧ稳定性下降。点突变产生新的糖基化位点也可影响 FⅧ的活性,去掉糖基后活性可恢复正常。CRM-或降低的患者,其突变可能影响蛋白质的折叠而使其稳定性下降。有些患者有相同的点突变,但临床表现却不一样,其原因不明,可能与不同的遗传背景或其他基因位点有关。有少数点突变影响mRNA前体的剪接,包括绝对剪接保守序列GT/AG的突变、延伸保守序列突变及突变产生新的剪接位点等〔3, 5, 6〕。
    FⅧ基因缺失绝大多数为重型,大小从1bp~100kb不等。没有发现明显的缺失突变热点。缺失突变(尤其是大片段缺失)易诱发 FⅧ抑制物产生。插入突变较少见,多为在同一碱基重复出现处插入,与滑动错配(slipped mispairing )模型相符〔7〕。
    最近根据铜蓝蛋白的三维结构构建了因子Ⅷ A区的模拟分子结构模型姫〕。根据这一模型可预测A区错义突变对结构和功能的影响〔9, 10〕。如果进一步全面阐明因子Ⅷ的立体结构,则将对分析基因突变与蛋白质结构和功能的关系以及血友病甲的治疗,特别是基因治疗,产生深远的影响。
  
  2 FⅧ的结构和功能
  
    FⅧ为一单链糖蛋白辅因子,在内源凝血途径中可加速因子IXa对因子X的激活过程。在血循环中,FⅧ以非共价方式与vWF形成复合物,这曾使FⅧ的分离提纯非常困难,并一度使vWF与FⅧ混为一谈。随着FⅧ纯品的问世及基因和cDNA的克隆,对FⅧ结构和功能已有了比较全面的了解。
    从cDNA推测FⅧ前体含有2 351个氨基酸。头19个氨基酸为疏水残基组成的信号肽。对氨基酸序列分析表明,FⅧ有6个结构域,3个A区:A1(1~336)、A2(375~719)、A3(1 691~2 025),1个B区(741~1 648),和2个C区:C1和C2,各约155个氨基酸,排列顺序为A1-a1-A2-a2-B-a3-A3-C1-C2。a1(337~374)、a2(720~740)和a3(1 649~1 690)为富含酸性氨基酸的短肽段。A区与铜蓝蛋白和凝血因子V(FV)的A区有很高的同源性。 而C区与盘基网柄菌属盘状蛋白凝集素和乳脂球膜蛋白有同源性。目前还没有发现与B区有同源性的蛋白质〔2, 3〕。
    FⅧ由肝细胞合成。在血浆中FⅧ与vWF形成复合物,可增加FⅧ的稳定性。血浆FⅧ是以重链(A1-A2-B)、轻链(A3-C1-C2)与钙离子形成的稳定复合物形式存在,含有数目不等的糖基,分子量最大的形式为330kD。另有90~210kD和80kD等形式。90~210kD的各种多肽是由于B 区在体内的不同加工过程所致,具有相同的N-端,都是从210kD形式衍生而来,由A1-A2加上不同长度的B区组成。80kD为C-端的A3-C1-C2组成的轻链〔11〕。
    FⅧ主要由凝血酶激活。其激活过程可以分为2个阶段,凝血酶先在1 689和740位切开,形成A1-a1-A2-a2/A3-a3-C1-C2复合物,具有部分活性。然后在372位切割,形成A1-a1/A2-a2/A3-C1-C2组成的异三聚体活性形式。因子Xa也以相类似的方式激活FⅧ。活化蛋白C(APC)在336位切割FⅧa而使其灭活〔11, 12〕。与vWF结合的FⅧ却不受APC的作用。此外,FIXa可在336和1 719位切割FⅧa而使之灭活。
  
  3 流行病学
  
    血友病的一般发病率为1/5 000~10 000(男性),其中约80%为血友病甲。法国Martinique小岛发病率高达16.7/105(其中血友病甲占77.4%),高于法国其他地区(6.6/105)。美国为10/105,相对较高。英国为6/105。日本相对较低,为2.3~2.5/105[〔13〕。80年代以前,我国对血友病的发病情况缺乏详细资料。1985年起,我国血友病协作组在全国各地进行了调查,统计标化患病率为2.73/105,其中血友病甲占80%,国内各地无明显地区差异。通过对211例血友病患者生存率分析,50岁以上生存率为65.5%±13.0%〔14, 15〕。致死主要原因为颅内出血。发达国家自70年代起,重型血友病患者寿命已接近正常人。所以,我国应把重点放在提高患者生存率上。
  
  4 诊断
  
  4.1 临床诊断
    80年代以前我国只能用凝血时间、凝血酶原消耗实验、活化部分凝血活酶时间(APTT)、凝血活酶生成实验等方法进行血友病甲的诊断,而且只能进行定性或半定量诊断。1982年,陈竺等〔15〕首先报告根据FⅧ活性对血友病甲进行分型。目前,我国已普遍采用FⅧ: C对血友病甲进行诊断和分型。虽然80年代中期已有人用免疫扩散法检测FⅧ: Ag,但目前仍未推广至临床常规应用。
    1981年,我国制订了统一的血友病诊断标准〔16〕。1986年又作了修订,主要以临床表现及免疫生化检测为诊断依据,按FⅧ: C水平分型〔17〕。近年来,结合国内外进展,对诊断标准作了进一步修订〔18〕。
    对血友病甲这样目前还没有根治手段的遗传病,鉴定携带者及产前诊断有利于优生优育,可以减少发病率。用FⅧ: C, FⅧ: Ag, 以及两者之比诊断携带者,即使是对肯定携带者,错判率仍高达10%,对可能携带者的诊断率也只有37%-46%〔19〕。产前诊断需在妊娠18~21周时取胎血测FⅧ: C及FⅧ: Ag水平, 危险性大,失败率高,并未广泛应用〔20〕。
  4.2 基因诊断
    随着FⅧ基因和cDNA的克隆,以及对FⅧ基因的广泛深入研究,不仅发现了大量基因突变,也确定了一些多态位点。多态位点可用来追踪突变基因,进行连锁分析,而找到基因突变则可进一步揭示血友病甲的分子病因,并有利于了解FⅧ结构和功能的关系。基于多态性的连锁分析和突变基因的直接检测都可用于鉴定携带者和产前诊断。然而,由于FⅧ基因庞大,外显子数量多,结构复杂,基因突变分散在所有外显子及其侧翼内含子序列上,呈高度异质性,且相当部分患者无家族史,这给直接检测基因突变带来极大不便。对未确定基因突变的患者家系,一般用连锁分析进行携带者诊断和产前诊断〔3, 7〕。
  4.2.1 间接基因诊断 目前在FⅧ基因内及其侧翼已发现约10个可用于基因诊断的多态位点(表1)。其中7个为限制性片段长度多态性(RFLPs),1个为内含子7中的单核苷酸多态位点(G/A),另2个为内含子13和22中的的微卫星标记(二核苷酸重复)。除此之外,还有一些与FⅧ基因紧密连锁的基因外多态位点,如St14(DXS52)的可变数目串联重复(Variable Number of Tandem Repeat, VNTR)等。在应用基因外多态位点进行连锁分析时,有可能因基因重组而产生误诊(~4%),所以,一般主张用基因内的多态位点作分析。
    RFLPs为双等位片段,杂合率不超过50%,即使联合运用多个RFLPs,多态信息含量(Polymorphism Information Content, PIC)也不会增加很多,当RFLPs之间出现连锁不平衡时尤其如此。国内沈岩等〔21〕于1987年首次用Bcl I RFLP为一血友病家系作携带者及产前诊断。黄淑贞等〔22〕(1989)应用PCR扩增包含Bcl I酶切位点的DNA片段,然后对扩增片段进行Bcl I酶切分析,成功地为一孕妇作产前诊断。曾溢滔等联合运用Bcl I, Xba I, Msp I/St14-1及Bgl Ⅱ/DX13等4个多态位点,可对85% 的血友病甲高危妊娠进行产前诊断〔23〕。在中国人中,多态信息含量较高的RFLP主要有18号内含子的BclI,19号内含子的HindⅢ,22号内含子的XbaI及MspI(表1)。
  
  表1 FⅧ基因内及其侧翼的多态位点
  
  内切酶 位 置 杂合率 检测方法
  白种人 中国人 PCR 探针
  TaqI 5'-端 0.40   - +
  BclI 内含子18 0.39 0.33 + +
  HindⅢ 内含子19 0.38 0.37 + +
  XbaI 内含子22 0.49 0.49 + +
  BglI 3' 0.25 0.00 - +
  MspI 3 ’ 0.43   - +
  MspI 内含子22 0.01 0.50 - +
  (CA)n 内含子13 0.80 0.60 + -
  (CA)n 内含子22 0.55 0.51 + -
  (G/A) 内含子7 0.33   + -
  
    王小冬等〔24〕(1993)、Yip等〔25〕(1994)及陈中等〔26〕(1996)对中国人内含子13及22的微卫星标记进行了研究。在白种人,内含子13 的(CA)n已发现10个等位片段,杂合率高达80%。而在中国人只发现7个等位片段,杂合率只有60%。内含子22的(CA)n在白种人有6个等位片段,杂合率为55%;中国人有8个等位片段,杂合率为51%〔7〕。
    基因外St14 VNTR也与白种人不同。中国人这一位点有7个等位片段,以较小片段出现的频率较高(700bp最常见),杂合率为60%〔27〕。白种人在这一位点至少有10个等位片段,以1 690bp频率最高,杂合率为81%〔28〕。以上资料表明,各种多态位点在不同种族间存在明显差异。
  4.2.2 直接基因诊断 直接检测FⅧ基因突变不仅揭示血友病甲的致病分子机制,同样也可用于携带者和产前诊断。对于较大的缺失、插入(>50bp)或倒位,以及影响限制性内切酶识别位点的突变,可用Southern 印迹杂交方法检测。对于单碱基置换,小缺失或插入,则需对FⅧ基因的所有编码区,侧翼内含子序列及5’端和3’端UTR进行全面分析。随着PCR的广泛应用,化学错配切割,寡核苷酸特异杂交,单链构象多态性(SSCP),变性梯度凝胶电泳(DGGE)等,结合DNA测序已被广泛用于FⅧ基因突变的筛查。应用这些方法已可检测出大多数血友病甲患者的基因突变。少数患者的突变可能位于内含子或FⅧ基因的调控序列中。Lin 等〔29〕(1993)及Chan等〔30〕(1995)分别对台湾和香港地区血友病甲的基因突变进行了研究。我们也对华东地区血友病甲基因突变进行了研究,并发现了一些新的突变类型〔31~34〕。总之,在中国人血友病甲基因突变中,内含子22倒位与国外报道相似,约占重型的50%,其余大多数为点突变,缺失和插入突变较少见。虽然在中国人群发现了一些新的突变,但突变类型、分布、频率等特点与白种人相近。目前对血友病甲进行直接基因诊断时,一般先对重型患者进行内含子22倒位筛查,然后用PCR-SSCP或DGGE,以及DNA测序等作进一步检测。
  5 治疗
  
  5.1 替代疗法
    国外从1964年开始用冷沉淀物取代新鲜(冷冻)血浆治疗血友病甲,使患者生存率明显提高,生活质量大大改善。1979年制备成功FⅧ冻干浓缩物,使不良反应大为减少〔1〕。80年代以前,我国主要用全血和血浆输注。80年代开始使用FⅧ浓缩制剂(多为中纯度)。目前,国外已用高纯度FⅧ制剂。因价格昂贵,国内尚未使用。
    1984年,重组FⅧ (rhFⅧ ) 表达成功,1988年进入临床实验。rhFⅧ在促凝活性、疗效及免疫原性等方面与血浆FⅧ相当,且更加安全〔35,36〕。1992年开始在美国和其他一些国家使用,但因含有人或动物白蛋白,可发生一些不良反应。1993年,第2代rhFⅧ,即去掉B区的rhFⅧ进入临床实验〔37〕,因其不含人或动物蛋白,其不良反应少,安全性更高,比活性高达15 000 IU Ⅷ: C/mg蛋白质,可使治疗费用大大降低,更有利于进行家庭治疗。目前,国内还未生产和使用rhFⅧ。
    替代疗法最大的问题是病毒感染和产生FⅧ抑制物。国外统计从1979~1984年约有一半血友病患者感染HIV病毒〔36〕。我国80年代使用进口FⅧ制剂的血友病患者已发现有HIV感染者〔38〕。肝炎也是替代治疗中的主要并发症。国外70年代末统计, 约11%血友病患者HBsAg持续阳性, 而88% HBsAb持续阳性。在我国血友病甲患者肝炎感染的发生率为81%〔39〕。自从应用血浆病毒灭活技术(热处理及溶剂/去污剂处理)以来,HIV、HBV和HAV感染已大大减少,但HCV感染却呈上升趋势〔13〕。两步法病毒灭活技术并不能杀灭细小病毒(Parvovirus),所以,应严格检查献血员的肝功能。而目前更引人注目的是克-雅氏病(Creutzfeldt-Jacob disease, CJD)的某些新的变异型。所以,目前发达国家倾向使用重组因子Ⅷ制剂。
    FⅧ抗体产生一直是捆扰血友病替代治疗的一个难题。国外报道其发生率约为20%,国内缺乏完整祥实 资料〔39〕。目前还不清楚FⅧ抑制物产生的机制,可能与FⅧ突变类型、患者的免疫状态及输注的剂型有关,多见于重型患者。对有FⅧ抗体产生的患者还没有有效的治疗手段。改用猪FⅧ 对某些患者有效,副反应较少。输注大剂量FⅧ(100u/kg, 2次/天)可降低FⅧ抗体水平,对部分患者有效。对急性出血者,其抗体浓度可达10BU/ml以上,不宜用人或猪因子Ⅷ浓缩物,而用重组因子VⅡa可奏效〔40〕。有人正试用免疫抑制疗法,但疗效还不确切。
  5.2 基因治疗
    血友病甲作为基因治疗的目标有以下几个有利条件:人及几种哺乳动物FⅧ基因已被克隆,蛋白质结构也初步阐明;血浆FⅧ水平较低(100~200ng/ml),只要达到正常5%便可获疗效;FⅧ基因的表达不需精确调控。但由于各种各样的原因,血友病甲的基因治疗进展却很慢,仍只限于基础研究和动物实验〔41〕。最近已在动物模型表达了治疗水平FⅧ,但持续时间不够长〔42, 43〕。目前正研究新的载体,使FⅧ能在体内持续高水平表达。我所克隆了FⅧ 的全长cDNA〔44〕,并在体外表达了高水平的FⅧ〔45〕,这为我国进行血友病甲的基因治疗研究打下了基础。最近,有人提出基因治疗的一种新设想,不是利用载体导入正常因子Ⅷ基因替代突变基因,而是利用RNA/DNA嵌合寡核苷酸来纠正目标DNA的单碱基突变〔46〕。虽然还未取得实质性进展,但这代表了未来基因治疗的趋势。
  
  作者单位:上海第二医科大学附属瑞金医院上海血液学研究所,上海200025

 

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