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逆转录病毒载体介导人凝血因子Ⅷ的体外高效表达

作者:王鸿利等 时间:2000-10-23 12:44 浏览:

摘要 目的:

        血友病A(Hem0philia A,HA)传统的替代治疗存在病毒污染、抗体产生、价格昂贵和不易获得等难以解决的问题。基因治疗是根治HA的理想模式之一。逆转录病毒载体可以稳定整合至宿主细胞的染色体,有利于实现目的基因的长期稳定表达。为了探讨逆转录病毒载体用于HA基因治疗的可能性,我们构建了重组人FⅧ逆转录表达载体,并观察其在体外不同靶细胞中的表达。方法: 采用Sall和Xh0l酶切pGRE5.2/EBV-FⅧBD(本室构建),得到长4.6Kb的FⅧBD cDNA,将此片继克隆至pLNCX的Hpal位点,构建pLNC-FⅧBD将一B区缺失(760aa~1639aa)的人FⅧ cDNA(FⅧBD cDNA)克隆至逆转录病毒载体pLNCX,构建了重组表达载体pLNC-FⅧBD。采用脂质体(Lip0factaMINE,GIBCOBRL)介导pLNC-FⅧBD转染包装细胞PA317,10~14天后,G418抗性克隆形成,分离并扩增各单克隆细胞。采用NIH3T3细胞感染法检测病毒滴度。选择产病毒滴度最高的单克隆PA317细胞,收集其24小时培养上清,5倍稀释后,感染靶细胞NIH3T3、CHO、COS-7和L-02。CHO细胞的G418筛选浓度为400μg/ml,其他三种细胞为300μg/ml。两周后抗性克隆形成,分离并扩增各单各隆。分别采用一期法、ELISA法和PT-PCR检测细胞培养上清中人FⅧ的凝血活性(FⅧ:C)和抗原含量(FⅧ:Ag)以及细胞中FⅧBD cDNA的转录。结果: 构建的pLNC-FⅧBD全长11.2Kb,经酶切和测序均证实重组载体构建正确。pLNC-FⅧBD转染PA317后,13/48的G418抗性克隆培养上清中FⅧ:C较未转染的PA317细胞提高10倍以上(>.01U/106细胞/ml/24hrs),最高的达到0.24U/106细胞ml/24hrs。NIH3T3感染后形成的G418抗性克隆数目显示这些阳性克隆的病毒滴度为104~105cfu/ml,最高达到5×105cfu/ml。pLNC-FⅧBD在NIH3T3、CHO、COS-7和L-02细胞中有不同程度的表达。其中以NIH3T3细胞的表达量最高,FⅧ:C活性达到1.6U/106细胞/ml/24hrs,FⅧ:Ag达到了500ng/106细胞/ml/24hrs。CHO细胞表达次之,COS-7和L-02细胞表达FⅧ较低。FⅧ活性和抗原检测具有良好的一致性。RT-PCR可检测到靶细胞中人FⅧBD cDNA的转录的mRNA。结论:逆转录病毒载体能够介导人FⅧ的体外高效表达,为血友病A的基因治疗奠定了基础。
    关键词 逆转录病毒载体 人凝血因子Ⅷ 基因表达
  
    血友病A(Hem0philiaA,HA)是临床常见的X染色体连锁的遗传性出血性疾病,患者因为基因缺陷导致血浆FⅧ缺乏或活性下降。传统的替代治疗存在病毒污染、抗体产生、价格昂贵和不易获得等难以解决的问题。基因治疗是根治HA的理想模式之一。然而就目前采用的大都数表达体系而言,FⅧ的表达水平还难以满足基因治疗的要求。逆转录病毒载体可以稳定整合至宿主细胞的染色体,有利于实现目的基因的长期稳定表达。继我室对一B区缺失的FⅧcDNA的体外表达作了初步研究之后[1],为了探讨逆转录病毒载体用于HA基因治疗的可能性,我们构建了重组人FⅧ逆转录表达载体,并观察其在体外不同靶细胞中的表达。
  
    材料和方法
    1.重组逆转录表达载体pLBC-FⅧBD的构建 B区大部分缺失(760aa~163aa)的FⅧcDNA克隆(FⅧBDcDBA)由中科院生化所戚正武院士惠赠,逆转录病毒载体pLBCX购自Cl0nbtech公司。采用Sall和Xh0l酶切pGRE5.2/EBV-FⅧBD(本室构建),得到长4.Kb的FⅧBDcDBA,将此片断克隆至pLBCX的Hpal位点,构建pLBC-FⅧBD(图1)。
  
  
  
    2.细胞系和细胞培养 PA317、CHO、COS-7和BIH3T3细胞为本所冻存的细胞系。正常成人肝细胞系L-02购自中科院细胞库。细胞培养条件为含10%新生牛血清(Hycl0的DMEM(GIBCO-RL),37℃,5%CO2。
    3.重组逆转录病毒的包装和克隆筛选 采用脂质体(Lip0factaMIBE,GIBCO-BRL)介导pLNC-FⅧBD转染包装细胞PA317,具体操作参照产品手册。转染后5小时更换新鲜培养液。48小时后,1:4传代细胞,更换含G418(Amresc0)的选择性培养基进行筛选,g418的筛选浓度维持在600mg/ml。10~14大后,G418抗性克隆形成,分离并扩增各单克隆细胞,进行病毒滴度和FⅧ活性的检测,并采用RT-PCR检测各克隆中FⅧBDcDBA的转录。
    4.病毒滴度的检测 采用BIH3T3细胞感染法。收集各抗G418的PA317细胞克隆的48小时培养上清,作100、1000、10000倍稀释。分别滴加lml含8mg/ml的聚凝胺(P0lybrene,Sigma)的病毒稀释液于六孔板中60%~80%融合的NIH3T3细胞表面,37°C,5%CO2培养2.5小时后,更换含维持浓度300mg/ml的G418的选择性培养基进行筛选。两周后,G418抗性克隆形成。计算抗性克隆数目和病毒液稀释倍数的乘积即得病毒的滴度。
    5.感染靶细胞 选择产病毒滴度最高的单克隆PA317细胞,收集其24小时培养上清,5倍稀释后,感染靶细胞NIH3T3、CHO、COS-7和L-02,感染方法同上。CHO细胞的G418筛选浓度为400mg/ml,其他三种细胞为300mg/ml。两周后抗性克隆形成,分离并扩增各单克隆,检测人FⅧ表达的活性和抗原含量以及人FⅧBDcDNA的转录。
    6.人FⅧ活性和抗原含量测定 FⅧ活性(FⅧ:C)检测采用一期法,在ST4血液凝固仪上完成(乏FⅧ血浆购自Diagn0stic Stag0公司)。FⅧ抗原(FⅧ:Ag)采用ELISA法检测(由中科院生化所协助完成)。标准品用含血清的细胞培养基稀释后作标准曲线。
    7.人FⅧBD cDNA的转录 采用TRlz0l(GIBCO-BRL)抽提细胞总RNA。RT-PCR检测FⅧBD cDNA转录的mRNA(试剂盒购自GIBCO公司)。设计一对FⅧBD cDNA特异的引物,上游引物序列为5’—CCAACATGATGGCATGGAAG-3’,下游引物序列为5’-CGAGGACTAAGGGAGCATA-3,扩增片断为250bp。逆转录条件为70°C退火10分钟,45°C反应50分钟。PCR扩增条件为95°C 30”,58°C30”,72°C30”,30个循环后,电泳观察结果。
  
    结果
    1.重组逆转录表达载体pLNC—FⅧBD的构建 构建的pLNC—FⅧBD全长11.2Kb。报据酶切图谱,采用Clal和BglII酶切分别只存在于载体和目的基因片断上的相应的单克隆酶切位点,鉴定重组载体拼接方向正确与否。正向拼按时,双酶切后应得到2.9Kb和8.3Kb两条片断。经酶切和测序均证实重组载体构建正确(图2)〔测序结果未显示)。
    2.病毒的包装和滴度的测定pLNC—FⅧBD转染PA317后,13/48的G418抗性克隆培养上清中FⅧ:C较未转染的PA317细胞提高10倍以上(>0.01U/106细胞/ml/24hrs),最高的达到0.24U/106细胞ml/24hrs。NIH3T3感染后形成的G418抗性克隆数目显示这些阳性克隆的病毒滴度为104~105cfu/ml,最高达到5×105cfu/ml。
    3.靶细胞中人FⅧ的表达 pLNC—FⅧBD在NIH3T3、 CHO、COS-7和L-02细胞中有不同程度的表达(表1)。其中以NIH3T3细胞的表达量最高,FⅧ:C活性达到1.6U/106细胞/ml/24hrs,FⅧ:Ag达到了500ng/106细胞/ml/24hrs。CHO细胞表达次之,COS—7和L-02细胞表达FⅧ较低。FⅧ活性和抗原检测具有良好的一致性。
  
  表1 重组逆转录表达载体pLBC-ⅧBD在四种靶细胞中的表达
  
  
  靶细胞
   FⅧ:C(U/106细胞/ml/24hrs)
   FⅧ:Ag(bg/106细胞/ml/24hrs
  
  NIH3T3
   1.60
   500
  
  CHO
   0.12
   62.4
  
  COS-7
   0.018
   4.8
  
  L-02
   0.011
   3.6
  
  
  注:以正常人混合血浆的FVⅢ:C为IU/ml,FVⅢ:Ag为200ng/ml
  
    4.FⅧBDcDBA的转录 在所有48个转染后具有G418抗性的PA317克隆中,13个阳性克隆(FⅧ∶活性大于0.01U/106细胞/ml/24hrs)均扩增山预期的250bp大小的片断,而在35个阴性克隆(FⅧ活性小于0.01U/106细胞/ml/24hrs)中也有2个克隆扩增出特异的250bp条带。感染后的BIH3T3、CHO、COS-7和L-02各单克隆细胞也都扩增出期望的特异条带(图3)。
  
  
  
    讨论
    虽然早在1984年人FⅧcDBA克隆就已成功并在体外获得低水平表达[2],但至目前为止,FⅧ的体内外表达效率还很低,难以满足基因治疗的需要。因此,建立一个能够实现FⅧ高效稳定表达的表达体系是血友病A基因治疗研究的重点之一,这涉及到载体-Ⅷ基因-靶细胞三者之间的相互匹配。
    由于逆转录病毒载体可以稳定地整合到靶细胞的染色体上,有利于实现目的基因的高效稳定表达。我们构建了一重组逆转录表达载体,观察其介导人FⅧ基因转移和表达的效率。RT-PCR、FⅧ:C及FⅧ∶Ag的检测结果表明,pLBC-FⅧBD可以很好地介导FⅧ在包装细胞和多种靶细胞中的基因转移和表达,尤其是在BIHH3T3细胞中表达很高,达到了500ng/106细胞/ml/24hrs,远远高于以往采用质粒载体在相同细胞以及肿瘤细胞中的表达[1],也高于其他研究小组的结果[3,4]。值得注意的是,2个检测不到FⅧ:C的包装细胞克隆也显示有FⅧBDcDNA的转录,提示FⅧ的表达效率与其在染色体上的整合位点密切相关。因此,进行克隆筛选是非常必要的。我们在BIHH3T3细胞中获得的高表达也与严格的克隆筛选有关。
    研究证实:B区缺失的FⅧcDNA不仅可以产生与野生型FⅧ活性相同的FⅧ,而且其表达效率是全长FⅧcDNBA的5~10倍。我们采用的FⅧcDBA缺失了760aa~1639aa的编码序列,但保留了影响FⅧ活性的1648位精氨酸等重要位点[5]。转染后,细胞上清中检测到较高的FⅧ活性,且FⅧ:C和FⅧ:Ag之间具有良好的一致性。
    适宜的靶细胞也是提高表达效率的重要因素之一。我们选择了四种不同类型的细胞系作为靶细胞。其中pLNC-FⅧBD在CHO和COS-7细胞中的表达分别为62.4和24bg/106细胞/ml/24hrs,与其他作者的报道相近[3]。另外,pLBC-FⅧBD在一正常成人肝细胞系L-02呈低水平表达。虽然肝脏被认为是人体中表达FⅧ的主要器官,并且体内的基因转移试验也证实肝脏是最主要的被转染组织,有些细胞系也可表达高水平的FⅧ,但不同的肝细胞系介导的FⅧ表达差异很大[6]。因此我们推测除了实验条件有待优化外,这种低表达可能与L-02的某些内在特性有关,但其确切机制未明。pLNC-FⅧBD在BIH3T3细胞的表达效率高达500ng/106细胞/ml/24hrs,这可能与成纤维细胞分裂生长旺盛,易于感染有关。再者,成纤维细胞属于已分化细胞,大多数外源基因都能得到很好的表达。另外,其还具有易于取材和体外培养、易于植入体内、必要时也易于移出体外的优点。因此,成纤维细胞是基因治疗较为理想的靶细胞之一。
    以上均为我们在细胞系中得到的实验结果,由于细胞系和原代培养细胞存在一定的遗传性差异,基因的体内和体外表达也存在一定的差异,因此重组逆转录表达载体介导的FⅧ在原代培养细胞以及体内的表达有待进一步研究。

 

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